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第一章基础篇1

第一节分子生物学实验室常用基本器具1

一、常用基本器具1

二、常用器具的材料6

第二节通用实验设备及其使用方法9

一、天平9

二、pH计11

三、分光光度计11

四、微量移液器12

五、离心机15

六、恒温箱17

七、振摇器19

八、超净工作台20

第三节实验室基础准备工作21

一、实验用水的制备21

二、消毒灭菌23

三、液氮的使用26

四、实验器具的硅化27

五、实验用醇及酚类的准备28

一、分子生物学实验室常用试剂浓度表示法31

第四节实验用试剂31

二、试剂的保存32

三、实验室中试剂的管理32

第五节安全防护32

一、放射性核素的防护32

二、危险化学试剂及防护33

三、生物安全防护34

第二章核酸的基础理论36

第一节核酸36

一、核酸的组成与结构36

二、核酸的理化特性42

三、核酸的光谱学44

四、核酸的降解与合成45

第二节基因与染色体47

一、基因47

二、染色体53

第三节细胞分裂周期59

一、有丝分裂59

二、减数分裂62

一、复制66

第四节遗传信息的传递66

二、转录70

三、翻译75

第三章核酸的制备80

第一节真核细胞DNA的制备80

一、概论80

二、从培养的动物细胞或组织中提取高分子质量DNA84

三、血液样品中DNA的制备87

四、残存蛋白质和RNA的检测88

一、试剂89

第二节细菌细胞DNA的提取89

五、真核细胞基因组DNA制备中的注意事项89

二、实验流程90

三、制备大分子质量细菌DNA的几个关键步骤91

第三节质粒DNA的分离纯化91

一、概论91

二、氯化铯密度梯度离心法93

三、碱裂解法94

四、煮沸法97

五、试剂盒提取及纯化质粒97

第四节RNA的制备98

一、RNA的结构和分布99

二、RNA制备中的关键因素101

三、组织细胞总RNA分离制备103

第四章电泳技术107

第一节电泳技术的基本原理107

第二节影响泳动率的因素108

一、样品108

二、支持介质108

四、缓冲液的离子强度110

三、电场强度110

第三节凝胶电泳的基本技术和条件111

一、核酸凝胶电泳的分类111

二、缓冲液系统112

三、样品的配制112

四、电泳条件的考虑113

五、染色113

六、电泳结果的记录115

第四节琼脂糖凝胶电泳116

一、仪器设备及材料117

二、电泳操作步骤118

第五节碱性琼脂糖凝胶电泳120

第六节聚丙烯酰胺凝胶电泳122

一、仪器设备及试剂123

二、制胶准备124

三、制胶125

四、电泳126

五、染色及结果观察126

第七节双向电泳127

一、等电聚焦电泳128

二、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳138

三、双向电泳结果的分析鉴定144

第八节凝胶扫描、成像系统148

第五章工具酶151

第一节限制性内切酶151

一、概述151

二、常用的三种内切酶153

三、其他类型内切酶157

四、甲基化酶158

五、与内切酶相关的几个概念160

六、限制性内切酶酶切反应161

七、DNA分子的限制性内切酶酶谱163

一、DNA聚合酶165

第二节DNA重组常用的其他酶类165

二、RNA聚合酶167

三、DNA连接酶168

四、反转录酶168

七、核糖核酸酶H169

八、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶CL3169

九、脱氧核糖核酸酶I169

六、核糖核酸酶T1169

五、核糖核酸酶A169

十、核酸酶S1170

十一、核酸酶Bal31170

十二、核酸外切酶170

十三、末端转移酶170

十四、多核苷酸激酶171

十五、碱性磷酸酯酶171

第六章基因克隆技术172

第一节目的基因DNA的制备172

一、从染色体中获得172

三、聚合酶链式反应扩增特定的基因片段174

二、人工合成174

第二节基因克隆载体175

一、质粒176

二、噬菌体185

三、真核细胞为宿主的克隆载体194

四、反转录病毒载体202

第三节DNA分子的体外重组204

一、DNA连接酶204

二、外源性基因DNA片段与载体DNA的连接207

三、影响DNA连接的因素212

第四节重组DNA导入宿主细胞213

四、DNA在凝胶内的连接213

一、转化的方法214

二、氯化钙法转化大肠杆菌（全部过程需无菌操作）215

三、重组DNA克隆的筛选与鉴定218

第五节基因组文库的构建222

一、构建基因文库的准备条件223

二、基因文库的构建226

第六节cDNA文库的构建235

一、总RNA的提取及mRNA的制备236

二、cDNA文库的构建238

第七章聚合酶链式反应244

第一节PCR基本原理244

一、基本原理244

二、“长产物片段”与“短产物片段”246

三、平台效应248

第二节PCR反应条件的优化249

一、标准PCR反应流程249

二、PCR反应条件的优化249

一、设计原则254

第三节引物的设计254

二、引物长度255

三、引物的5＇端修饰法256

四、简并引物257

五、嵌套引物258

第四节PCR反应模板的制备259

第五节耐热DNA聚合酶260

一、TaqDNA聚合酶260

二、其他耐热DNA聚合酶263

二、热启动PCR的几种技术265

一、热启动PCR的原理265

第六节热启动PCR265

第七节降落PCR268

第八节PCR相关技术的发展269

一、不对称PCR269

二、多重PCR271

三、着色互补PCR272

四、巢式PCR272

五、锚定PCR273

六、反向PCR273

八、增敏PCR275

七、锅柄PCR275

九、重组PCR276

十、表达PCR277

十一、原位PCR278

十二、RNA的聚合酶链反应279

十三、cDNA末端快速扩增280

十四、差异显示PCR286

十五、定量PCR286

第九节PCR产物的检测295

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳296

一、琼脂糖凝胶电泳296

四、分子杂交297

五、微孔板夹心杂交法297

三、层析技术297

六、限制性内切酶酶切分析298

七、酶免疫法检测PCR298

八、PCR扩增产物的直接测序299

第十节PCR的污染及对策299

一、PCR污染299

三、对照实验300

二、污染的预防300

四、污染源的处理301

第十一节PCR技术的应用302

一、基因分析302

二、定序克隆308

三、序列分析309

第八章核酸分子探针的标记311

第一节概述311

一、探针的种类及其选择311

二、各种标记物及其选择312

三、各种标记方法及其选择317

第二节非放射性DIG标记方法317

一、非放射性DIG标记方法的比较317

二、PCR标记法319

三、随机引物标记法322

四、体外转录标记RNA探针325

五、三种标记方法重要参数的比较简表329

第三节探针标记效率的评估330

一、直接检测过程330

二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR标记探针331

第九章核酸分子杂交332

第一节Southern杂交332

一、琼脂糖凝胶分离DNA样品332

二、DNA的转膜（Southern印迹，虹吸印迹法）333

三、预杂交336

四、DIG标记的DNA探针与靶DNA的杂交337

第二节RNA探针的Northern杂交342

一、琼脂糖凝胶分离RNA样品342

二、RNA的转膜（Northern印迹，虹吸印迹法）343

三、预杂交344

四、DIG标记的RNA探针与RNA的杂交345

五、做核酸杂交时，如何取得良好结果345

第三节非放射性核素探针的检测347

一、光学检测347

二、化学发光检测349

第四节使用DIG标记的探针进行菌落和噬菌斑的杂交351

一、菌落／噬菌斑滤膜的准备步骤351

二、DIG标记的DNA探针与菌落／噬菌斑滤膜的杂交353

三、化学发光法检测探针－靶基因杂交信号353

四、显色法检测探针－靶基因杂交信号354

五、菌落／噬菌斑杂交的影响因素355

第五节核酸原位杂交355

一、核酸原位杂交的基本要点355

二、结果的评定358

附：Western印迹检测表达蛋白质359

一、哺乳细胞的裂解359

二、蛋白质的电转移359

三、封闭360

四、靶蛋白与第一抗体反应360

六、显色361

五、与第二抗体反应361

第十章测序362

第一节概论362

第二节Sanger双脱氧法363

一、基本原理363

二、经典测序反应——M13单链测序系统366

三、双链DNA测序反应系统375

四、循环测序法378

五、PCR产物直接测序380

一、化学法基本原理383

第三节Maxmam-Gilbert化学法383

二、化学法测序的一般流程385

三、化学法的优缺点387

第四节杂交测序388

第五节自动化测序392

一、自动化测序仪392

二、全自动化测序流程399

第六节DNA大片段序列测定的战略405

一、随机测序405

二、定向测序法409

三、全基因组测序策略411

第七节DNA测序技术新进展414

第十一章新技术419

第一节mRNA差异显示技术419

一、概述419

二、基本原理423

三、实验设计和优化424

四、实验操作431

五、差异显示技术衍生的方法440

六、差异显示技术的应用441

七、存在的问题和解决的策略450

八、展望451

第二节生物芯片452

一、生物芯片技术的基本原理453

二、生物芯片技术的特点453

三、生物芯片的应用454

四、生物芯片技术存在的问题及发展前景457

第三节激光捕获纤维切割技术459

一、LCM技术的主要原理及简单操作459

二、LCM技术的特点、存在问题及相应对策460

三、LCM技术在生命科学研究中的应用状况461

四、LCM技术的发展前景462

第十二章生物信息学及其在分子生物技术中的应用465

第一节概述465

一、生物信息学的概念465

二、生物信息学的发展466

三、生物信息学的研究现状469

第二节生物信息学的研究方法和内容471

一、研究方法471

二、研究内容489

一、生物信息数据库及其分类494

第三节生物信息数据库494

二、生物信息数据库介绍495

三、数据库的查询497

四、全球生物信息数据库499

第四节序列比对和数据库搜索511

一、序列比对511

二、数据库搜索513

第五节生物信息学的应用516

一、序列分析516

二、核酸序列装配和拼接524

三、电子基因定位525

四、基因表达的电子组织分布528

五、功能预测529

六、蛋白质结构预测531

七、向数据库提交序列532

八、SNP分析533

第六节研究实例534

一、实例一534

二、实例二539

三、其他研究路线540

二、常用的缓冲液和试剂543

附录543

一、遗传密码子表543

三、铬酸洗液及配制方法551

四、放射性核素资料552

五、核酸及蛋白质数据553

六、常用分子质量标准参照物554

七、细胞培养中出现的常见问题、原因及解决方法556

八、分子生物学研究中的网上资源557

缩略语559

索引564